Analyses diagnostiques

Mise au point d'analyses diagnostiques

On met au point de nouveaux tests en fonction de besoins variés, par exemple la détection d'un nouvel agent pathogène ou d'un agent pathogène s'installant dans un nouvel hôte, l'accroissement de la sensibilité d'un test ou de la rentabilité d'un autre, l'élaboration d'analyses au moyen d'échantillonnage non létal et l'amélioration du contrôle de la qualité. Lorsque le SLNSAA songe à mettre au point une analyse diagnostique, il respecte les lignes directrices de l'OIE et s'assure que l'analyse convient à son objectif et est bien caractérisée. L'amélioration continue et l'offre de résultats de qualité sont des principes clés du système de gestion de la qualité du SLNSAA. L'élaboration et la validation d'analyses diagnostiques à qualité contrôlée sont essentielles pour la détection et l'identification précises des agents pathogènes et permettent à la direction de prendre des décisions bien informées, fondées sur des données et des conseils scientifiques fiables.

Diagnostic Test Validation

On utilise traditionnellement l'isolement des virus et les essais bactériologiques et histologiques pour détecter les virus, les bactéries et les parasites; c'est ce que recommandent les ouvrages scientifiques pour la détection de plusieurs agents pathogènes. Depuis l'inauguration du PNSAA, les laboratoires réunis dans le SLNSAA ont entamé la validation des protocoles d'essai, en portant une attention particulière aux méthodes de biologie moléculaire comme la PCR quantitative. La validation est un processus qui consiste à déterminer si une méthode est appropriée, si elle a été convenablement élaborée et est optimisée et normalisée relativement à ce pour quoi on l'a conçue. La validation porte sur l'exactitude, la précision, la spécificité, le seuil de détection, la limite de dosage, la linéarité, la portée et la robustesse. C'est un processus continu qui évalue le rendement d'un protocole d'essai et qui le caractérise. Pour qu'un protocole demeure validé, il faut en surveiller étroitement le rendement au fil du temps et dans des conditions d'utilisation régulière, afin de s'assurer qu'il continue d'atteindre ses fins prévues. Les processus de validation du SLNSAA sont fondés sur les lignes directrices de validation de l'OIE.

Sample Processing

Tous les sujets présentés au laboratoire sont évalués, afin de déterminer s'ils sont propres à l’analyse, et on leur attribue un code unique ou un numéro, après avoir noté les renseignements qui les concernent. Ce numéro accompagne l'échantillon et tous les sous-échantillons, afin d'assurer la traçabilité de la réception au traitement, à l'analyse, à la rédaction du rapport et à la mise au rebut. Au besoin, on soumet les poissons, mollusques et crustacés à une autopsie et on recueille les tissus ou parties d'organes aux fins d'analyse. Une fois les échantillons testés, on prépare un rapport, et les résultats sont remis au client. À tous les stades du processus, on signale immédiatement à l'ACIA la détection d'un agent pathogène à déclaration obligatoire. Lorsque l'analyse est terminée et les rapports finaux expédiés, les échantillons sont conservés ou mis au rebut, conformément à la politique du SLNSAA.

Les laboratoires du SLNSAA disposent d'une large gamme d'outils de diagnostic pour la détection des agents pathogènes. Les analyses les plus fréquemment utilisées dans les laboratoires sont les suivantes : autopsie (observation macroscopique), isolement du virus, culture bactérienne, histologie et réaction en chaîne de la polymérase (PCR). Plusieurs autres tests sont disponibles, mais restent moins utilisés.

Lors de l'expédition d'échantillons recueillis sur des animaux aux fins d'analyses diagnostiques, comme les tissus ou les organes, on doit se conformer à des normes très strictes pour que les échantillons arrivent au laboratoire dans un état satisfaisant pour l'analyse. Les échantillons qui n'ont pas été stockés de la manière prescrite se dégradent, et les résultats des analyses risquent d'être moins fiables.

Techniques de détection des agents pathogènes

• Faux positifs et faux négatifs

  Faux positifs et faux négatifs

  Dans la prévention et le contrôle des maladies d'animaux aquatiques, il existe une étape cruciale qui consiste à détecter et à identifier avec précision l'agent pathogène. On appelle « faux négatif » un résultat d'analyse qui classe un animal comme étant ni exposé à un agent pathogène, ni infecté par lui, quand en vérité l'animal est bien infecté (cela est souvent lié au fait que l'agent est présent, mais en trop faible quantité). Un « faux positif » classe incorrectement un animal comme étant exposé à l'agent pathogène ou infecté par lui, alors qu'il n'y a aucune infection.

  Au cours d'une analyse, on prend des mesures pour éviter les résultats faussement positifs ou faussement négatifs. Un protocole détaillé, décrivant les étapes de la méthode d'essai, doit être suivi chaque fois que l'analyse est effectuée. Au cours du processus d’analyse, on emploie des contrôles positifs et négatifs et on crée un dossier complet qui respecte les indications des systèmes de gestion de la qualité et de l'information du laboratoire, afin de garantir la fiabilité des résultats. Par ailleurs, les analystes du MPO bénéficient d'une formation exhaustive et doivent détenir l'agrément permettant d'exécuter certains processus d'analyse avant qu'on ne les autorise à traiter des échantillons en vue du diagnostic. Lorsqu'une analyse donne un résultat positif, il est de pratique courante, dans un laboratoire de diagnostic, de recourir à d'autres protocoles pour confirmer le résultat du test initial. Lorsque les résultats doivent contribuer à la prise d'une décision de réglementation, il est important qu'ils inspirent confiance et que l'on comprenne exactement ce qu'ils représentent.

  Un résultat d'analyse « faux positif »

  détermine que l'animal est infecté par l'agent pathogène recherché, quand en fait il ne l'est pas.

  Un résultat d'analyse « faux négatif »

  détermine que l'animal ne recèle pas l'agent pathogène recherché, quand en fait il en est infecté.

• Autopsies

  Autopsies

  Lorsqu'un animal entier arrive au laboratoire, on examine l'extérieur du corps et les organes internes pour relever les signes de maladie. Toute anomalie, par exemple des lésions endommageant les tissus, les érosions ou ulcères, les décolorations, une hémorragie ou un œdème, est notée, pour le cas où elle permettrait de déterminer si un agent pathogène est présent et quelle est son incidence. Pendant l'autopsie, on recueille des échantillons de tissus et d'organes aux fins de tests ultérieurs au moyen d'autres analyses diagnostiques.

• Isolement du virus

  Isolement du virus

  Les animaux aquatiques, tout comme les hommes et les autres animaux, sont vulnérables aux infections virales. Les virus sont des parasites intracellulaires obligatoires qui ont besoin de cellules vivantes pour se reproduire. Quoique les œufs embryonnés et les animaux de laboratoire soient très utiles pour isoler certains virus, les cultures cellulaires sont l'unique moyen employé à cette fin dans la plupart des laboratoires voués à la santé des animaux aquatiques. Lors de la préparation d'un échantillon en vue d'une analyse comportant l'isolement du virus, les tissus recueillis à l'autopsie sont réduits en un mélange homogène, que l'on injecte ensuite dans des lignées cellulaires précises; le tout est mis en incubateur sous surveillance pendant une période donnée, à la température qui convient au virus. Si l'échantillon contient un virus, celui-ci se reproduit (et son nombre augmente), au point qu'il finit par causer des changements et des dommages aux cellules. C'est ce qu'on appelle l'« effet cytopathologique », que l'on peut observer au microscope. Les changements visibles que certains virus engendrent dans les cellules peuvent prendre des jours, voire des semaines à se manifester; c'est pourquoi les analystes doivent examiner les cultures cellulaires à intervalle de quelques jours. Dès l'apparition de l'effet cytopathologique, on prend des mesures supplémentaires pour confirmer l'identité du virus.

• Bactériologie

  Bactériologie

  

  La bactériologie est la branche de la microbiologie qui étudie les bactéries, soit les organismes unicellulaires qui sont susceptibles de causer des maladies chez les animaux aquatiques. Lorsqu'on veut détecter un agent pathogène bactérien, au moment d'une autopsie, on recueille une petite quantité d'un tissu visé et on l'étend au moyen d'une anse d'inoculation sur un média, dans une boîte de Petri. On dépose celle-ci, pendant plusieurs jours, dans une étuve conservée à la température convenant à la croissance des bactéries. Le média des boîtes de Petri contient de la gélose, c'est-à-dire un liquide nutritionnel permettant la croissance des bactéries. Ces dernières, si elles sont présentes dans le tissu, sont ainsi alimentées et se reproduisent en colonies. Lorsque des colonies sont observées, elles sont soumises à d'autres analyses, en vue de les identifier.
• Histologie

  Histologie

  L'histologie est la science de l'observation des tissus et des cellules au moyen d'un microscope. Quoique servant à identifier des maladies spécifiques du poisson et des crustacés, c'est l'outil le plus couramment utilisé pour détecter des agents pathogènes dans les mollusques. Pendant l'autopsie, on recueille les tissus visés, on les fixe au moyen de substances chimiques, puis on les enrobe de paraffine. On coupe alors le bloc de paraffine en tranches ultraminces que l'on place sur une lame de microscope. On laisse ensuite sécher les lames, puis on emploie une teinture biochimique pour teindre les tissus et l'on scelle enfin les lames. En histologie, quand il s'agit de mollusques ou de crustacés, la teinture la plus courante est composée d'hématoxyline et d'éosine. Les lames sont ensuite examinées au microscope par un analyste. Cette personne suit un protocole précis lors de cette analyse. On peut évaluer la condition physiologique générale de l'animal et la détection des parasites se fait par observation visuelle directe des tissus.

• Biologie moléculaire

  Biologie moléculaire

  Chaque virus a une empreinte génétique unique. L'épreuve de réaction en chaîne de la polymérase (test de PCR) est une technique qui se penche sur des portions précises de cette empreinte de façon à les dépister et à les identifier. Une analyse de la PCR aboutit à un diagnostic précis, et les laboratoires de santé des animaux aquatiques s'en servent pour détecter l'acide désoxyribonucléique (ADN) ou l'acide ribonucléique (ARN) de bactéries, de parasites ou de virus. Dans les laboratoires du SLNSAA, cette technique est actuellement utilisée pour détecter soit l'ADN, soit l'ARN d'un seul agent pathogène à la fois. Les tests portent soit sur la simple PCR conventionnelle, soit sur la PCR quantitative. L'analyse selon la PCR quantitative est extrêmement sensible et très précise; les données sont rassemblées en temps réel et les résultats sont obtenus très rapidement. On reconnaît une réaction positive grâce à l'accumulation de signaux fluorescents, et les résultats sont exprimés en chiffres, si l'échantillon contient l'agent pathogène. Le résultat numérique représente le seuil de cycle, c'est-à-dire le nombre de cycles nécessaire pour qu'un signal fluorescent traverse le seuil ou les signaux d'arrière-plan. La valeur Ct est inversement proportionnelle à la quantité d'agents pathogènes présents dans l'échantillon; autrement dit, plus faible est la valeur Ct, plus grande est la quantité d'agents pathogènes dans l'échantillon, puisqu'on n'aura pas besoin d'autant de cycles pour les détecter. Dans une réaction de la chaîne de polymérase conventionnelle, le produit de la PCR est visible sur un gel. La distance que franchit une bande indique si l'agent pathogène visé est présent. Bien que la PCR conventionnelle prends plus de temps pour le traitment d’échantillons, on peut utiliser le produit d’une PCR conventionnelle pour obtenir la séquence génétique de l'agent pathogène.

  Le dépistage de cette minuscule cible génétique de l'acide ribonucléique (ARN) du virus constitue un résultat « positif » présumé. Le test de PCR est une épreuve d'une sensibilité extrême qui donne parfois des résultats faussement positifs; c'est pour cette raison que les échantillons ayant donné des résultats présumés positifs doivent être confirmés par des tests supplémentaires qui jouent le rôle d’essais de contrôle.

  Les essais de contrôle peuvent prendre deux formes : Dans un premier temps, il faut tenter d'isoler le virus des tissus hôtes grâce à la culture cellulaire. Cette dernière permet au virus d'infecter les cellules et de se multiplier comme il le ferait chez le poisson hôte. Il est possible d'obtenir un résultat positif au test de PCR, puis finalement, un résultat négatif de l'essai de culture cellulaire. L'essai de culture cellulaire requiert qu'une dose minimale de virus vivant soit présente dans l'échantillon à l'essai et cela peut prendre jusqu'à quatre semaines avant que l'on puisse y détecter l'infection. Dans un deuxième temps, il faut identifier correctement le virus. On emploie habituellement, pour ce faire, les techniques conventionnelles du test de PCR pour grossir des portions différentes des gènes viraux, qui sont ensuite séquencées, puis comparées avec l'empreinte unique du virus.

• Qualité des tissus

  Qualité des tissus

  Plusieurs facteurs doivent être pris en compte dans les épreuves de dépistage par la PCR, en ce qui a trait à la qualité des échantillons ou des tissus de poisson. Premièrement, la nature du test de PCR exige que l'échantillon soit frais ou bien conservé. Le poisson doit être prélevé vivant, moribond ou mort depuis peu (moins de 24 heures). Parce que l'ARN de l'hôte (poisson) et du virus se dégrade rapidement après la mort, il peut rapidement devenir impossible de dépister le virus par PCR ou toute autre méthode de dépistage acceptée. Parce que l'ARN se dégrade rapidement, un autre test, appelé épreuve de détection du gène de référence, peut être effectué sur l'extrait d'origine. Le résultat de ce test indique le niveau de dégradation de l'échantillon par comparaison à un échantillon bien conservé de la même espèce. Si l'ARN est considérablement dégradé, ni un test de PCR, ni quelque autre méthode de dépistage approuvée ne pourra déterminer, avec quelque degré d'assurance que ce soit, la présence ou l'absence du virus. Si la dégradation de l'échantillon est source d'inquiétude, on peut faire d'autres analyses pour vérifier si les résultats d'un test sont précis.

  Les tissus de poisson recueillis aux fins d'analyse par PCR doivent être soit congelés sans attendre, soit déposés dans une solution appelée « RNAlater », pour préserver l'ARN. La dégradation des tissus et du virus se produit même à une température de - 20 ºC; la conservation à long terme requiert l'entreposage à - 70 ºC.

  En deuxième lieu, comme un virus s'attaque à des organes en particulier, il est important de choisir l'organe ou les tissus visés pour le dépistage par PCR. On peut aussi utiliser les branchies ou quelque autre organe ou tissu extérieur, mais les résultats seront sujets à caution, puisqu'ils peuvent indiquer uniquement que des particules virales sont présentes dans l'environnement. Ils ne signifient pas forcément que l'hôte est infecté.

  En dernier lieu, la taille de l'organe ou des tissus devrait être suffisante pour qu'on puisse réaliser les épreuves. Un échantillon de la taille d'un grain de riz permet de faire des tests de PCR et des tests de confirmation moléculaire (séquençage). Des quantités sensiblement plus importantes sont requises pour la culture cellulaire et à des fins d'archivage pour référence ultérieure et pour d'autres tests.